132 Sequenzierung der Basenabfolge Heutzutage kann man durch Sequenzierung schnell und genau die Abfolge von Basen in der DNA feststellen. Dabei wird der zu analysierende DNA-Abschnitt vervielfältigt, wobei per Zufallsprinzip Abbruchnukleotide eingebaut werden. Nach ihnen kann der neu synthetisierte Strang nicht verlängert werden. Denn einem Abbruchnukleotid fehlt die OH-Gruppe, an der die DNA-Polymerase das nächste Nukleotid anhängen würde. Zudem ist es – je nach Base – mit einem bestimmten Fluoreszenzfarbstoff markiert. Durch die extrem große Anzahl an PCR-Produkten und die relativ hohe Anzahl an Abbruchnukleotiden entstehen bei jeder PCR unterschiedlich lange Produkte (kAbb. 6). Diese werden in einer dünnen, mit Gel gefüllten Kapillare der Länge nach aufgetrennt: Das nachfolgende PCR-Produkt ist immer genau eine Base länger als das vorherige. Das jeweilige Fluoreszenz-Molekül wird von einem Laser angeregt und gibt danach Licht einer bestimmten Wellenlänge ab. Dieses wird wiederum gemessen und so mit Hilfe eines Computers die genaue Basenabfolge bestimmt (kAbb. 6). Moderne Sequenziermethoden ermöglichen es, in kurzer Zeit ganze Genome zu sequenzieren. Dabei entstehen riesige Datenmengen. Ein Berufsfeld, das daher zunehmend an Bedeutung gewinnt, ist die Bioinformatik. Der Einbau von Abbruchnukleotiden mit Fluoreszenzfarbstoffen bei der PCR ermöglicht eine genaue Analyse der Basenabfolge eines DNA-Abschnitts Der Ansatz enthält einzelsträngige Proben-DNA, DNA-Polymerase, einen DNA-Primer für den als Matrize dienenden DNAStrang und ein Gemisch aus Nukleotiden (A, T, G, C). Es werden Strangabbruch-Nukleotide (A*, T*, G*, C*) zugesetzt, denen die OH-Gruppe fehlt, an der die DNA-Polymerase das nächste Nukleotid anhängt. 1 normale Nukleotide (A, T, G, C) Strangabbruch-Nukleotide (A*, T*, G*, C*) A T G C A* T* G* C* einzelsträngige Proben-DNA (Matrize) ab hier unbekannte Sequenz 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ C A A C G G G T 3‘ 5‘ A* A* C* C* G* G* G* T* Am zugehörigen Farbsignal von A*, T*, G*, C* lässt sich eine Sequenz ablesen, die komplementär zum Matrizenstrang ist. Kapillar-Elektrophorese Fluoreszenzdetektor Detektor-Ausgabe DNA-Primer DNA-Polymerase Bei der DNA-Synthese werden A, T, G, C oder A*, T*, G*, C* von der DNA-Polymerase eingebaut. Nach A*, T*, G*, C* bricht die Synthese jeweils ab. Es entstehen unterschiedlich lange DNA-Stränge. In einer Gel-Kapillare bewegen sich kurze DNA-Stränge schneller als lange. Abb.6: Mit der Strangabbruchmethode lässt sich die Basensequenz eines beliebigen DNA-Abschnitts entschlüsseln. A*, T*, G*, C* werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und die synthetisierten DNA-Stränge in einer gelgefüllten Kapillare elektrophoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt (Kapillar-Elektrophorese). Die Auswertung erfolgt mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektors. 2 Nur zu Prüfzwecken – Eigentum des Verlags öbv
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