am Puls Biologie 8, Schulbuch

120 Sequenzierung der Basenabfolge Heutzutage kann man durch Sequenzierung schnell und genau die Abfolge von Basen in der DNA feststellen. Dabei wird der zu analysierende DNA-Abschnitt vervielfältigt, wobei per Zufalls­ prinzip Abbruchnukleotide eingebaut werden. Nach ihnen kann der neu synthetisierte Strang nicht verlängert werden. Denn einem Abbruch­ nukleotid fehlt die OH-Gruppe, an der die DNA-Polymerase das nächste Nukleotid anhän- gen würde. Zudem ist es – je nach Base – mit einem bestimmten Fluoreszenzfarbstoff markiert. Durch die extrem große Anzahl an PCR-Produk- ten und die relativ hohe Anzahl an Abbruch­ nukleotiden entstehen bei jeder PCR unter- schiedlich lange Produkte ( k Abb. 6). Diese werden in einer dünnen, mit Gel gefüllten Kapil- lare der Länge nach aufgetrennt: Das nachfol- gende PCR-Produkt ist immer genau eine Base länger als das vorherige. Das jeweilige Fluores- zenz-Molekül wird von einem Laser angeregt und gibt danach Licht einer bestimmten Wellenlänge ab. Das wiederum wird gemessen und so von einem Computer die genaue Basenabfolge be- stimmt ( k Abb. 6). Moderne Sequenziermethoden ermöglichen es, in kurzer Zeit ganze Genome zu sequenzieren. Dabei entstehen riesige Datenmengen. Ein Be- rufsfeld, das daher zunehmend an Bedeutung gewinnt, ist die Bioinformatik . Der Einbau von Ab- bruchnukleotiden mit Fluoreszenz- farbstoffen bei der PCR ermöglicht eine genaue Analyse der Basenabfolge eines DNA-Abschnitts Der Ansatz enthält einzelsträngige Proben-DNA, DNA-Polymerase, einen DNA-Primer für den als Matrize dienenden DNA- Strang und ein Gemisch aus Nukleotiden (A, T, G, C). Es werden Strangabbruch-Nukleotide (A*, T*, C*, G*) zugesetzt, denen die OH-Gruppe fehlt, an der die DNA-Polymerase das nächste Nukleotid anhängt. 1 normale Nukleotide (A, T, G, C) Strangabbruch-Nukleotide (A*, T*, C*, G*) A T G C A* T* G* C* einzelsträngige Proben-DNA (Matrize) ab hier unbekannte Sequenz 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ A A C C G G G T 3‘ 5‘ A* A* C* C* G* G* G* T* Am zugehörigen Farbsignal von A*, T*, G*, C* lässt sich eine Sequenz ablesen, die komplementär zum Matrizenstrang ist. Kapillar-Elektrophorese Fluoreszenzdetektor Detektor-Ausgabe DNA-Primer DNA-Polymerase Bei der DNA-Synthese werden A, T, G, C oder A*, T*, G*, C* von der DNA-Polymerase eingebaut. Nach A*, T*, G*, C* bricht die Synthese jeweils ab. Es entstehen unterschiedlich lange DNA-Stränge. In einer Gel-Kapillare bewegen sich kurze DNA-Stränge schnel- ler als lange. Abb. 6: Mit der Strangabbruchmethode lässt sich die Basensequenz eines beliebigen DNA-Abschnitts entschlüs- seln. A*, T*, C*, G* werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und die synthetisierten DNA-Stränge in einer gelgefüllten Kapillare elektrophoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt (Kapillar-Elektrophorese). Die Auswertung erfolgt mithilfe eines Fluoreszenzdetektors. 2 Nur zu Prüfzwecken – Eigentum des Verlags öbv