Big Bang HTL 4, Schulbuch

Biotechnologie 6 Biochemie und Biotechnologie (IV. Jahrgang, 7. Semester) 77 1. DNA-Isolation Die Gewinnung des notwendigen DNA-Abschnitts erfolgt mittels PCR (Siehe Abschnitt 6.1). Die DNA-Vorlage dafür muss im Falle des Insu- lins aus menschlichen Zellen stammen, z. B. aus einer Mundschleim- hautprobe. Abb. 6.24: Entnahme einer Mundschleimhaut-Probe 2. Restriktion Ein Vektor ermöglicht die Übertragung eines DNA-Ab- schnitts in ein anderes Lebewesen. Bei Bakterien und Hefe- zellen als Zielorganismus verwendet man dafür Plasmide (siehe Kapitel 1), also kleine DNA Ringe aus nur wenigen tausend Basen. Die verwendeten Plasmide enthalten immer auch das Gen für eine Antibiotikaresistenz, die für Schritt 5 (Selektion) benötigt wird. Mit speziellen Enzymen ( Restrikti- onsenzymen ) kann die DNA eines Vektors aufgeschnitten werden. Die Enden des Schnittes gehen nicht gerade durch die DNA sondern sind an den zwei Strängen um einige Ba- sen versetzt. Auch das vervielfältigte Enzym wird mit densel- ben Enzymen an den Enden beschnitten. Dies ermöglicht das anschließende „Zusammenkleben“ der beiden Teile. 3. Ligation Durch das Enzym Ligase (siehe Replikation, Kapitel 5) wird das Gen in das Plasmid geklebt. Abb. 6.26: Ligation 4. Transfer des Plasmids in die Bakterienzelle Der als Transformation bezeichnete Prozess ermöglicht die Aufnahme des Plasmids in das Bakterium. Es ist nach einer einfachen Vorbehandlung mit CaCl 2 in der Lage Plasmide aus der Lösung aufzunehmen. Die verwendeten Bakterien dürfen selbst keine Antibiotikaresistenz tragen. Abb. 6.25: Auf- schneiden des Plasmids mit Restriktions- enzymen Abb. 6.27: Transformation und Selektion 5. Selektion Nun werden die Bakterien vermehrt. Um jene Bakterien her- auszufiltern, die das Plasmid mit der Antibiotikaresistenz und dem gewünschten neuen Gen enthalten, bringt man sie auf einem Nährboden mit Antibiotikum aus. Nur jene Bak- terien, die das Plasmid mit der Antibiotikaresistenz in sich tragen, können wachsen. Auch die heterologe Expression (also die Herstellung des Produkts) muss dann in Anwesen- heit des Antibiotikums erfolgen. ( F17 ) V 6.2 DNA Extraktion aus Tomaten Geräte und Chemikalien: Tomaten, Kochsalz, Zitronensaft filtriert, Spülmittel (kein Konzentrat), Messer, Mörser oder Stabmixer, Kaffeefilter, Trichter, Ethanol 96%ig , Bechergläser, Reagenzglas mit Stopfen, Zahnstocher, Eisbad Durchführung: – Schneide eine halbe Tomate in kleine Stücke. – Fülle die Tomatenstücke in den Mörser oder ein Becher- glas und gib 1 g Salz, 5ml Spülmittel, 25ml Zitronensaft und 30ml Wasser hinzu. Zerreibe das Gemisch im Mörser oder mixe kurz mit dem Stabmixer. – Filtriere nun das Gemisch durch den Kaffeefilter, kühle das Filtrat dabei am Eisbad. – Überführe nun ca 2–3ml des Filtrats in ein Reagenzglas und gib die 3–4 fache Menge an kaltem Ethanol hinzu. Mische durch vorsichtiges Umdrehen des verschlossenen Reagenzglases. – Die DNA ist nun als weißer Niederschlag zu erkennen, der sich mit einem Zahnstocher herausziehen lässt. Aufgaben: – Überlege bzw recherchiere die Funktionen der einzelnen Reagenzien (Salz, Spülmittel, Zitronensäure, Ethanol) Entsorgung : Restmüll e Nur zu Prüfzwecken – Eigentum des Verlags öbv